Выявление COVID-19 методом ОТ-ПЦР

Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) (англ. reverse transcription polymerase chain reaction RT-PCR) представляет собой современный технологичный способ выявления специфического генетического материала у любого патогена, включая вирус COVID-19. Обратная транскрипция – это ферментативный синтез молекулы ДНК из матрицы РНК. Полученная ДНК, известная так же как комплиментарная ДНК, может быть использована в качестве шаблона для ПЦР-амплификации.

Обратная транскрипция с последующей ПЦР известна как ОТ-ПЦР

Первоначально для обнаружения целевых генетических материалов метод ОТ-ПЦР использовал радиоактивные изотопные маркеры, однако его последующее улучшение привело к замене изотопной маркировки специальными флуоресцентными красителями. Данный метод позволяет ученым получить результаты почти сразу, пока процесс еще продолжается, в то время как обычная ОТ-ПЦР дает результаты только по завершению процесса.

ОТ-ПЦР представляет собой разновидность ПЦР. Оба метода используют один и тот же процесс, но ОТ-ПЦР предполагает дополнительный этап обратной транскрипции РНК в ДНК для обеспечения возможности амплификации. ПЦР используется для выявления вирусов и бактерий, которые уже содержат ДНК для амплификации, а ОТ-ПЦР – для выявления патогенов с РНК, которая должна быть транскрибирована в ДНК для амплификации. Оба метода могут быть выполнены в «реальном времени».

В Украине изготовлением диагностических наборов на основе ОТ-ПЦР занимается компания Биокор Текнолоджи. Приоберсти такие наборы можно по ссылке https://biocor-tech.com/ru/projects/biocore-sars-cov-2

Вирус и генетический материал

Вирус – это микроскопический пакет генетического материала в молекулярной оболочке, который может быть представлен либо дезоксирибонуклеиновой (ДНК), либо рибонуклеиновой кислотой (РНК). ДНК представляет собой двухцепочечную молекулу, содержащаяся во всех организмах, включая животных, растения и вирусы, которая несет генетический код или схему того, как эти организмы создаются и развиваются.

Подобно некоторым другим вирусам коронавирус SARS-CoV-2, который является причиной инфекционного заболевания COVID-19, содержит только РНК. Это означает, что для размножения и выживания ему требуется проникновение в здоровые клетки. Оказавшись внутри, вирус SARS-CoV-2 использует свой собственный генетический код, чтобы контролировать клетки и превращать их в своеобразные «фабрики» по производству вирусов.

Чтобы обнаружить вирус, подобный COVID-19, на ранней стадии с помощью ОТ-ПЦР требуется преобразование РНК в ДНК. Этот процесс называют «обратной транскрипцией». Определенная часть транскрибированной вирусной ДНК копируется (амплифицируется) сотни тысяч раз. Вместо того чтобы пытаться обнаружить ничтожное количество вируса среди миллионов цепочек генетической информации, метод предполагает получение множества целевых участков вирусной ДНК, чтобы подтвердить наличие вируса.

ПЦР при диагностике COVID-19

Образец берется из областей, где предположительно концентрируется вирус COVID-19, например, нос или горло. Образец обрабатывается несколькими химическими растворами, чтобы удалить белки и жиры и отделить присутствующую в нем РНК. Извлеченная РНК представляет собой смесь собственного генетического материала человека и РНК вируса (если человек инфицирован).

РНК транскрибируется в ДНК с помощью специфического фермента. Затем к ним добавляются дополнительные фрагменты ДНК, соответствующие некоторым фрагментам транскрибируемой вирусной ДНК. В случае присутствия в образце вируса, эти фрагменты прикрепляются к целевым участкам вирусной ДНК. Некоторые из этих добавленных фрагментов предназначены для конструирования нитей ДНК, в то время как другие – для добавления к ним маркерных меток, по которым затем выявляется вирус.

Полученная смесь помещается в прибор, в котором она последовательно нагревается и охлаждается, чтобы создать новые, идентичные копии целевых участков вирусной ДНК. Цикл повторяется несколько раз, удваивая число копий ДНК. Стандартная процедура ОТ-ПЦР предполагает 35 таких циклов. В результате из каждой присутствующей в образце нити вируса, создается около 35 миллиардов новых копий участков вирусной ДНК.

По мере создания новых копий участков вирусной ДНК маркерные метки прикрепляются к нитям ДНК, а затем выделяют флуоресцентный краситель, который фиксируется компьютером и отображается в реальном времени. Компьютер отслеживает объем флуоресценции в образце после каждого цикла. Превышение определенного уровня флуоресценции подтверждает, что вирус присутствует. Чтобы оценить тяжесть инфекции, отслеживается за сколько циклов этот уровень был достигнут – чем меньше циклов, тем тяжелее вирусная инфекция.

Преимущества ОТ-ПЦР

Метод ОТ-ПЦР – это надежный способ подтвердить диагноз COVID-19 всего за три часа, в то время как лабораторное исследование занимает в среднем от шести до восьми часов. По сравнению с другими доступными методами выделения вирусов ОТ–ПЦР в реальном времени значительно быстрее и точнее других лабораторных тестов. Это по-прежнему самый точный из доступных методов выявления вируса COVID-19.

Однако метод ОТ-ПЦР в реальном времени не может быть использован для выявления инфекций и вирусов, от которых организм уже избавился, что крайне важно для понимания развития и распространения пандемии, поскольку вирусы присутствуют в организме человека лишь в течение короткого промежутка времени. Для отслеживания и изучения прошлых инфекций, особенно тех, которые могли развиваться и распространяться бессимптомно, требуются другие методы.

Ложноотрицательные результаты

Хотя ОТ-ПЦР в реальном времени дает явные преимущества по сравнению с более традиционными методами, результаты анализа все же следует интерпретировать с осторожностью. В частности, эффективность ОТ-ПЦР для выявления SARS-CoV-2 в значительной степени зависит от объема, типа и сроков сбора клинических образцов. Существует высокая вероятность получения ложноотрицательного результата из-за некачественной нуклеиновой кислоты или присутствия ингибиторов. Эта проблема может быть устранена параллельным выявлением гена рибонуклеазы, который должен присутствовать во всех адекватно собранных образцах.

Ложноотрицательные результаты могут также потенциально возникать из-за мутаций, происходящих в праймерных и зондовых целевых областях генома SARS-CoV-2. Данную ошибку также можно решить – за счет включения в анализ нескольких генетических мишеней и тщательного сравнения праймерных и зондовых последовательностей с опубликованными последовательностями SARS-CoV-2 по мере их появления.

Чтобы исключить ложноположительные результаты во время приготовления экстрактов нуклеиновых кислот и реакций амплификации следует также предотвратить введение загрязняющей вирусной РНК или ранее амплифицированной ДНК.